瓊脂糖偶聯甘露糖的凝膠的制備
2025-11-12
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瓊脂糖偶聯甘露糖的凝膠制備主要涉及瓊脂糖與甘露糖的混合及凝膠化過程，以下是詳細的制備步驟及注意事項：
一、材料準備
瓊脂糖：選擇合適的瓊脂糖濃度，根據目標分子大小調整。例如，分離1kb以下DNA推薦使用1.5%濃度，大片段（>5kb）則用0.5%濃度。
甘露糖：作為配體，與瓊脂糖混合以改善凝膠性能。
緩沖液：常用TAE（Tris-Acetate-EDTA）或TBE（Tris-Borate-EDTA），需與制膠緩沖液一致。
其他材料：制膠模具（含梳子）、電泳槽、染料（如溴化乙錠EB或更安全的RedView/GelGreen）等。
二、制備過程
緩沖液配制：
根據需要配制適當濃度的緩沖液，如將5×TBE緩沖液稀釋至0.5×TBE。
膠液制備：
稱取適量瓊脂糖，置于錐形瓶中。
加入配制好的緩沖液，放入微波爐或電爐上加熱至瓊脂糖全部熔化。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜，以減少水份蒸發。
膠板制備：
將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住，置于水平支持物上。
插上樣品梳子，注意梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入染料（如EB），使其終濃度為0.5μg/ml（也可電泳后再染色）。
用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻；速度也不可太快，否則容易出現氣泡。
凝膠凝固：
待膠凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠。
向槽內加入緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。
甘露糖偶聯（此步驟可能因具體實驗需求而異，以下是一種可能的偶聯方式）：
在凝膠制備過程中或制備后，通過化學方法將甘露糖偶聯到瓊脂糖凝膠上。這通常涉及使用偶聯劑（如碳二亞胺）將甘露糖的羧基與瓊脂糖的氨基或羥基連接起來。
偶聯條件（如溫度、pH值、反應時間）需根據具體實驗需求進行優化。
三、注意事項
溫度控制：瓊脂糖溶液溫度過高（>65℃）會導致孔徑不均，過低則凝固緩慢。倒膠前建議膠液冷卻至50-60℃。
氣泡排除：倒膠前用移液槍吸出氣泡，或加入少量異丙醇輔助消泡。灌膠后盡量排除梳孔之間或底部的氣泡。
凝膠厚度：凝膠厚度建議3-5mm，以獲得良好的分離效果。
染料選擇：EB具有致癌性，操作時需戴手套、護目鏡，染色后避免長時間暴露。可選擇無毒害性的核酸染料（如RedView）。
儲存條件：未用完的凝膠可浸泡于電泳緩沖液中，4℃保存不超過2周。
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